植物基因克隆技术及其应用
  • 发布单位:广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室
  • 2013年01月22日 09时43分54秒
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在生命科学飞速发展的今天,新基因的发现及其功能的研究一直是生命科学研究中的热点。用于植物基因克隆的方法有很多种。主要可分为三类:一种类型是功能克隆;第二种类型是表型克隆;第三类是无基因序列及表达功能信息,但具有转座子标签或基因遗传图谱等条件,常用转座子标签法克隆和图位克隆技术。

1 功能克隆方法

功能克隆(Functional Cloning)是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定已知基因功能的基础上克隆,其方法是在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因文库。DNA文库的筛选主要2种方法:(1) 将纯化的蛋白质进行测序,根据合成寡核苷酸探针从cDNA或基因文库中选出编码基因;(2) 将相应的编码蛋白制成相应的探针,从cDNA载体表达库中筛选相应的克隆。

2 表型克隆方法

目前,有很多植物既不了解它的基因产物,也没有对它们进行基因定位,但已知植物在表现型上存在着差异,利用表现型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆,是近年来发展十分迅速的一类方法,例如mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)、抑制性差减杂交(SSH)EST文库筛选技术等。

2.1 mRNA差异显示法

高等植物所有的发育和生理变化技术过程,不论是单基因还是多基因控制,都是通过基因表达的质或量的差异而体现出来。方法如下:1) 提取两种细胞的mRNA,反转录后成为两种cDNA(2) 以一定的引物作PCR扩增;3) 通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样品间的差异条带;4) 将差异DNA做成探针;5) cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析。

2.2抑制性差减杂交技术

抑制性差减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)Diatchenko等人于1996年建立的。抑制消减杂交技术的主要流程包括图:合成cDNA→两个样本均用Rsa酶切→将Tester分成两等份,连接上不同的接头,Driver不与接头相连→两份Tester分别与Driver混合,进行第一步差减杂交→将两份第一步差减杂交的产物未经变性就混合,进行第二步差减杂交→抑制性PCR扩增差异表达的序列→套式引物进行第二轮PCR扩增,使差异片段得到进一步富集→PCR扩增产物可作为探针进行文库筛选或T/A克隆构建差减文库→差异筛选cDNA差减文库→克隆挑选、测序。

SSH技术具有灵敏度高、操作简单、稳定、可靠等特点。SSH技术构建的cDNA文库中包含大量的EST序列,能高效、快速、大规模地得到差异表达的基因序列片段,从中获得新的。DNA序列,结合RACE、原位杂交等方法获得全长基因。SSH方法在植物上的应用主要是两个方面: (l) 植物的生长发育及组织特异性研究。(2) 生物及非生物逆境对植物的影响及引起的基因差异表达研究。

2.3 EST文库筛选技术

表达序列标签(Expressed Sequence Tags, ESTs)是从一个随机选择的cDNA克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一部分。这一概念首次由Adams等于1991年提出。EST最早也最常用于基因识别,还应用于物理图谱的构建、“电子”基因克隆等。

利用EST进行电子基因克隆的具体步骤可总结为:首先,用已知的EST序列为起始序列,采用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序检索数据库中与其同源或有部分重叠的EST序列,以确定哪些代表已知基因,哪些代表已知 EST,哪些代表新发现的EST序列;还可以多个EST序列电子延伸组装为基序(contigs),即通过与已知的EST序列重叠区(overlapping sequence)的配对延伸,组装成毗邻序列;以此基序为被检序列再进行BLAST检索;重复以上过程,直至没有更多的重叠EST检出,基序不能继续延伸为止,由此可以获得尽可能长或全长的cDNA 序列。

3 基因芯片技术

基因芯片又称 DNA 芯片 (DNAchip)DNA 微阵列(DNA microarray)DNA 微阵列芯片(DNA microarray chip),是最常见的生物芯片(biochip)之一,是以预先设计的方式将大量的生物讯息密码(寡核苷酸、cDNA、基因组 DNA )固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。

利用DNA芯片分离目的基因,首先进行序列分析,根据基因序列中特异的片段设计探针,制备出代表该生物所有基因的寡核苷酸或DNA阵列,即DNA芯片。然后将不同条件下从某生物体重转录出来的所有mRNA标记,与DNA芯片杂交,通过分析杂交位点及信号强弱,可得知在不同条件下各基因是否表达及各自表达程度。根据表达图谱进行不同条件下基因表达的对比分析,可找出在环境条件变化时,哪些基因表达变化,变化多大,从而分析这些基因的生理功能,进而找出与该生理功能相关的功能基因。

4 图位克隆技术

图位克隆(maplbased cloning)又称定位克隆(positional cloning),是由英国剑桥大学Coulson等人于1986年首次提出,它是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法。

定位基因克隆首先利用目标基因的近等基因系或分离群体分组分析法(BSA)进行连锁分析,筛选出目标基因所在局部区域的分子标记。构建以细菌作为寄主的载体系统用于目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因文库得到阳性克隆,然后以阳性克隆的末端作为探针基因组文库并进行染色体步行,直到找到目的基因紧密相连的分子标记。通过已有的遗传图谱和寻找新的基因标记,不断缩小新的候选区,利用侧翼的分子标记分析和混合样品作图精确确定目标基因,然后以目标基因两侧的分子标记为探针通过染色体登陆(找到与目的基因很近的分子标记,直至二者之间的距离小于基因文库中克隆的平均插入距离,就可以直接筛选到含有目标基因的克隆,最终得到候选基因)获得目的基因的阳性克隆,最后用外显子对多个基因进行分离、鉴定。

5 PCR扩增克隆技术

这是一种参考已知基因的序列克隆基因的方法。目前已经知道了很多植物基因的序列,当克隆类似基因时可先从基因文库中找到有关基因序列,然后用PCR方法克隆。其基本方法是根据已知基因的序列设计并合成一对引物,从植物中提取DNA进行PCR扩增,扩增的片段纯化后连接到适当的载体上,用酶切分析和序列分析检测重组子,并与已知基因序列进行比较。

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